Ю. Транова*, П. Ю. Мыльников, А. В. Щулькин, И. В. Черных, С. К. Правкин, Е. Н. Якушева
_________________________________________________________________________________________________
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Рязань, Российской Федерация
_________________________________________________________________________________________________
Введение. Белок устойчивости к раку молочной железы человека (BCRP, ABCG2) — транспортный белок суперсемейства АВС транспортеров, использующий энергию АТФ для своей работы. BCRP играет важную роль в фармакокинетике, поэтому новые лекарственные вещества рекомендуется тестировать на принадлежность к его субстратам, индукторам и ингибиторам. Оценку влияния веществ на активность данного белка-транспортера in vitro проводят по изменению трансмембранного переноса его субстратов, одним из которых является кверцетин. Это, в свою очередь, требует разработки и валидации метода его количественного анализа в соответствующей матрице.
Цель. Разработка метода количественного определения кверцетина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масс-селективным детектированием (МС/МС) и выполнении его полной валидации.
Материалы и методы. Метод разрабатывали на ВЭЖХ «Ultimate 3000», оснащенном МС/МС детектором TSQ Fortis («Thermo Fisher», США). Для проведения хроматографического анализа использовали колонку UCT Selectra C18 4,6 мм × 100 мм × 5 мкм, 100 A, предколонку Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18 GDC46-5UM. Время анализа составляло 11 мин при температуре разделения 35°С, скорости потока подвижной фазы 0,5 мл/мин и объеме вводимой пробы 5 мкл. Применяли градиентный режим элюирования: соотношение 0,1%-ного раствора муравьиной кислоты и ацетонитрила составило: на 0 мин 70% и 30%; 0,3 мин — 30% и 70%; 4 мин — 1% и 99%; 9 мин — 70% и 30%. Время удерживания кверцетина соответствовало 3,91 мин. Условия детектирования были следующими: негативный режим ионизации, мониторинг множественных реакций 301 m/z → 150,9 m/z при энергии столкновения 22 В и 301 m/z → 178,9 m/z при энергии столкновения 17 В, фрагментация источника 5 В, напряжение электроспрея 3000 В, давление CID-газа 1 мТорр, Sheath gas 50 Arb, Aux gas 10 Arb, Sweep gas 10 Arb, температура трубки для переноса ионов 300°С, температура испарителя 350°С. Матрицей служила транспортная среда после инкубации в течение 3 часов с клетками линии Сасо-2, гиперэкспрессирующими BCRP. В указанной среде в дальнейшем будет оцениваться транспорт кверцетина через клеточный монослой in vitro. Осаждение белка и выделение кверцетина из транспортной среды осуществляли смесью воды и ацетонитрила в соотношении 1:1.
Результаты. Разработанный метод был валидирован по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, матричный эффект, стабильность образцов. Аналитический диапазон методики находился в диапазоне 5–500 нмоль/л. Коэффициент корреляции составлял более 0,99. Предел обнаружения и нижний предел количественного определения кверцетина (НПКО) соответствовали 1 и 5 нмоль/л. Расчет внутри- и межцикловой точности и прецизионности показал, что данные параметры для НПКО не превышают 20 и 15% — для остальных концентраций. Стабильность аналита продемонстрирована при трехкратном цикле заморозки-разморозки при -80ºС, при хранении при -80°С в течение 60 сут, после пробоподготовки и нахождении в течение 24 ч в автосемплере. Перенос пробы и матричный эффект отсутствовали.
Выводы. Разработан метод количественного определения кверцетина с помощью ВЭЖХ-МС/МС в транспортной среде и выполнена его полная валидация.
Ключевые слова: кверцетин; ВЭЖХ-МС/МС; BCRP
2022 год, выпуск №3
Оригинальное исследование
Читать статью (pdf) →
DOI: 10.23888/HMJ2022103251-258
Для цитирования:
Транова Ю., Мыльников П. Ю., Щулькин А. В., Черных И. В., Правкин С. К., Якушева Е. Н. Метод количественного определения кверцетина с помощью ВЭЖХ-МС/МС // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2022. Т. 10, № 3. С. 251–258. https://doi.org/10.23888/HMJ2022103251-258.